pcr實驗總是出現(xiàn)假陽性，明明沒有加模板，最后卻擴出了產(chǎn)物。如果這種現(xiàn)象頻頻出現(xiàn)，就要注意一下操作環(huán)境。

　　這里涉及氣溶膠的概念，氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系，能在空氣中滯留至少幾個小時。

　　pcr反應(yīng)過程中不斷進行升溫降溫，液體蒸發(fā)又冷凝，pcr管中部分空氣形成氣溶膠，攜帶大量的dna擴增產(chǎn)物(注意，1ng擴增產(chǎn)物中可作為模板的dna片段數(shù)量，超過1ng起始模板中可擴增dna片段數(shù)量的幾百萬倍甚至更高。比如人的基因組dna有30億個bp，要擴增的單拷貝基因片段是300bp，1ng起始模板中可以作為模板dna片段只占總起始模板dna總量的千萬分之一)。如果在實驗室打開含pcr擴增產(chǎn)物的管蓋，大量攜帶dna擴增產(chǎn)物的氣溶膠就會涌出，擴散到空氣中，從而對環(huán)境造成污染。

　　雖然在整個空間環(huán)境中dna的含量很低，但由于理論上只要有1個可做為模板的dna片段也能pcr擴增成功，這就是為什么在污染環(huán)境中陰性對照也能擴增出條帶的原因。所以在專業(yè)的pcr實驗室(比如臨床pcr檢驗實驗室)，通常有四區(qū)隔離(或至少是三區(qū)隔離)的要求。 常見的三區(qū)是指：

　　1、試劑配制區(qū)：pcr反應(yīng)體系的配制區(qū)域。

　　2、標(biāo)本處理區(qū)：包括擴增模板的制備，即提取dna的地方。

　　3、pcr擴增和產(chǎn)物分析區(qū)：進行pcr擴增的區(qū)域，也是擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析的區(qū)域。

　　如果將pcr擴增區(qū)域和產(chǎn)物分析區(qū)再次分開，就是四區(qū)隔離。四區(qū)隔離，主要目的是防止氣溶膠在各個pcr區(qū)域之間的流動，最好的方法是每個區(qū)域隔一幢樓，但操作起來不現(xiàn)實，于是便有了針對不同區(qū)域設(shè)置正負壓的方法：

　　試劑配制區(qū)(ⅰ區(qū))：最潔凈的區(qū)域，保持微正壓使得外界空氣無法進入隔離污染源。并且陰性模板應(yīng)該在此區(qū)加入pcr管并蓋蓋，嚴(yán)禁在此區(qū)域打開、存放裝有dna模板的離心管。

　　dna模板添加區(qū)(ⅱ區(qū))：壓力比ⅰ區(qū)低，保證內(nèi)部空氣不外泄，以免陽性模板的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染。

　　擴增及pcr產(chǎn)物分析區(qū)(ⅲ區(qū))：保持負壓，使得內(nèi)部空氣不外泄，以免擴增產(chǎn)物的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染。

　　操作時壓力遵循ⅰ區(qū)→ⅱ區(qū)→ⅲ區(qū)單一方向進行，不可逆向進行。

　　既然pcr三區(qū)隔離的目的是為了阻斷氣溶膠的交流，請注意以下細節(jié)，思考一下氣溶膠來自哪里：

　　1. 每個區(qū)域都應(yīng)配備專用的移液器，不可交叉混用。我們的一位用戶拿電泳室的移液器加模板，陰性對照擴出了很亮的條帶。

　　2. 每個區(qū)域都應(yīng)配備專用的移液器吸頭，不可交叉混用。

　　3. 如果條件允許，在pcrⅲ區(qū)工作結(jié)束后再次進入pcr i區(qū)需要更換實驗服、一次性鞋套、帽子、手套。

　　4. 在pcr i區(qū)、pcrⅱ區(qū)配備帶濾芯吸頭。